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    公开号:WO1985000621A1
    申请号:PCT/EP1984/000196
    申请日:1984-06-28
    公开日:1985-02-14
    发明作者:Hubert KÖSTER
    申请人:Koester Hubert；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    [0001] Verfahren zur definierten Verknüpfung doppelhelikaler DNA-Fragmente mittels einer Linker-DNA sowie als Linker-DNA geeignete Oligonucleotide.
    [0002] Beschreibung
    [0003] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur definierten Verknüpfung doppelhelikaler DNA-Fragmente über kohäsive Enden mit den im Anspruch 1 angegebenen Merkmalen. Die Erfindung betrifft weiterhin eine doppelhelikale Linker-DNA der im Anspruch 1 angegebenen
    [0004] Formel I, in der R1, R2, X und n wie oben definiert sind. Das
    [0005] Verfahren bzw. die Linker-DNA der Erfindung kann für eine gezielte Veränderung des Erbmaterials verwendet werden.
    [0006] Restriktions-Linker sind bekannt (Scheller et al., Science Bd. 196, 177 (1977)
    [0007] und werden seit langem in der Molekularbiologie und Gentechnologie verwendet. Ihnen ist gemeinsam, daß die Erkennungsregion für die Restriktionsendonuclease im zentralen Teil der Oligonucleotidsequenz liegt und in der Regel im 5' - und 3' -endständigen Bereich von G-/C-reichen Sequenzen flankiert wird. Im folgenden werden zwei Beispiele für bekannte Linker-Sequenzen gegeben:
    [0008] Eco RI-Linker: d(GGAATTCC) Bam HI-Linker: d (CGGATCCG)
    [0009] Die Nachteile dieser Linker sollen im folgenden an einem Beispiel erläutert werden. Nach Ligation dieser Linker an DNA mit Hilfe von T4-Polynucleotidligase wird durch diese Linker das Erbmaterial (DNA) unweigerlich und irreversibel verändert, da nach dem "Schneiden" mit der entsprechenden Restriktionsendonuclease (gegebenenfalls nach erfolgter Klonierung etc.) auch nach Anwenden einer einzelstrangspezifischen Endo-/ Exonuclease, ein Teil der angekoppelten Linkernucleotide an der DNA verbleiben:
    [0010] Es wird deutlich, daß bei diesem Beispiel gemäß dem Stand der Technik die ursprüngliche DNA um 2 GC-Basenpaare verlängert wurde. Die Nachteile des bekannten Verfahrens können mit dem Verfahren bzw. der Linker-DNA der Erfindung vermieden werden, da sie ermöglichen, die ursprüngliche Erbinformation in unveränderter Weise zurückzugewinnen. Die Merkmale des Verfahrens der Erfindung ergeben sich aus dem kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1.
    [0011] Der hier verwendete Begriff "komplementär" bedeutet komplementär im Sinne von Watson und Crick. "Spiegelbildlich komplementär" bedeutet, daß zwei Sequenzen komplementär sind, wenn die eine von links nach rechts und die andere von rechts nach links gelesen wird.
    [0012] Die Oligonucleotide I weisen normalerweise ebenso wie die ersten und zweiten DNA-Fragmente am 5' -Ende eine Phosphatgruppe auf; fehlt diese am Oligonucleotid I, ist lediglich dafür zu sorgen, daß das 1. bzw. 2. DNA-Fragment an der Verknüpfungsstelle für die Linker-DNA eine 5'-ständige Phosphatgruppe aufweist. Fehlt die Phosphatgruppe im ersten oder zweiten DNA- Fragment, muß das Oligonucleotid I eine 5' -Phosphatgruppe aufweisen.
    [0013] Wenn R eine der durch Kombination der vier Nucleotide A, T, C und G möglichen, nicht in sich selbst komplementären Tetranucleotidsequenzen ist, ergeben sich die aus Tabelle 1 ersichtlichen Sequenzen. Wenn R eine der durch Kombination der vier Nucleotide A, T, C und G möglichen, nicht in sich selbst komplementären Pentanucleotide ist (in Anbetracht der ungeraden Nucleotidzahl sind Pentanucleotidsequenzen ausschließlich nicht in sich selbst komplementär), erhält man durch analoge Permutation die hier im einzelnen nicht wiedergegebenen möglichen Sequenzen, z.B.
    [0014] Sinngemäß können auch durch entsprechende Permutation die Kombinationsmöglichkeiten für in sich selbst oder nicht in sich selbt komplementäre Hexanucleotide aus den Nucleotiden A, T, C und G erhalten werden, z.B.
    [0015]
    [0016] Für die hier angesprochenen Fälle, daß R1 eine nicht in sich selbst komplementäre Tetra- oder Penta- oder eine in sich oder nicht in sich selbst komplementäre Hexanucleotidsequenz ist, gilt, daß R2 die zu R1 spiegelbildlich komplementäre Sequenz mit gleicher Kettenlänge aufweisen muß, z.B.
    [0017] (5')ACTA(X)nTAGT(3').
    [0018] (5') CACACA (X) nTGTGTG (3')
    [0019] (5')AAATTT(X)n AAATTT(3') Weiterhin gilt für diese Fälle, daß entweder R1 oder R2 ein einziges Ribonucleotid enthalten muß, und zwar in den endständigen Positionen 3' oder 5', oder gegebenenfalls auch X ein 3'- oder 5'-endständiges Ribonucleotid enthält, z.B.
    [0020] (5')C*ACAGC*TGTG(3'),
    [0021] wobei R1 = C*ACA, R2 = TGTG und X = GC* bedeuten und die
    [0022] Ribonucleotide durch * markiert sind.
    [0023] Es gilt die Regel, daß zur Erzeugung kohäsiver Enden in dem Spacer X ein Ribonucleotid vorhanden sein muß , wenn entweder R1 oder R2 ein Ribonucleotid aufweisen; ein
    [0024] Ribonucleotid im Spacer X ist dagegen nicht erforderlich, wenn R1 und R2 je ein Ribornucleotid enthalten.
    [0025] Es ist jedoch auch möglich, daß R1 und R2 5'- oder 3 '-ständige Ribonucleotide enthalten, wobei die jeweilige Positionierung des Ribonucleotids bestimmt, welche Kettenlänge das übertragene kohäsive Ende aufweist.
    [0026] Weiterhin gilt, daß T* (Ribothymidin) durch das gleichwirkende U* (Ribouridin) ersetzt sein kann.
    [0027] Eine Aufzählung und Beschreibung von Restriktionsendonucleasen der Klassen II und III ist in der Firmenschrift "Restriction Endonucleases" der Boehringer Mannheim GmbH, 1981, enthalten; diese Veröffentlichung enthält auch Restriktionsendonucleasen der Klassen II und III, die für das Verfahren der Erfindung verwendbar sind, in der folgenden Beschreibung jedoch nicht namentlich genannt werden.
    [0028] Mit dem Verfahren der Erfindung lassen sich - 1, 2 , 3, 4, 5 oder 6, vorzugsweise 4, Nucleotide aufweisende kohäsive Enden auf die erste DNA übertragen, wobei Nucleotide aus der Spacer-Gruppe X nicht mit übertragen werden. Es ist jedoch auch möglich, wie später an einem Beispiel gezeigt wird, aus dem Spacer X ein oder mehrere Nucleotide mit auf die erste DNA zu übertragen, und zwar bei geeigneter Positionierung eines Ribonucleotids in der Gruppe X.
    [0029] Die Ausbildung der kohäsiven Enden an der 1. DNA erfolgt durch Spaltung des aus der 1. DNA und der Linker-DNA erhaltenen Reaktionsproduktes, das in allgemeiner Schreibweise wie im Schema I dargestellt werden kann (am Schluß der Beschreibung).
    [0030] Im Schema 1 bedeutet N die die Reste R1 bildenden Nucleotide A, T, G und/oder C bzw. A*, T*, G*, C* und/oder U* und X die oben definierte Oligonucleotidgruppierung mit 2-30 Nucleotideinheiten. Weiterhin sind mit Pfeilen die Spaltungspositionen gemäß vier Spaltungsvarianten a, b, c und d dargestellt, auf die im folgenden eingegangen wird.
    [0031] Varianten a, b:
    [0032] Die Spaltung erfolgt mittels Restriktionsendonucleasen der Klassen II bzw. III und führt zu der Ausbildung eines kohäsiven Endes an der Fremd-DNA, das die gleiche Nucleotidzahl aufweist wie die Gruppe R1 bzw. R2 der Linker-DNA.
    [0033] Je nach Spezifität der Endonuclease wird das kohäsive Ende am 5'- oder 3'-Ende der Fremd-DNA erzeugt.
    [0034] Varianten c, d:
    [0035] Die Spaltung erfolgt mittels Basen bzw. RNA-sen, setzt somit voraus, daß an den Spaltungspositionen Ribonucleotide A*, T*, C*, G* oder U* vorhanden sind, wobei zu beachten ist, daß die Spaltung immer am 3'-Ende des Ribonucleotids erfolgt. Je nach Positionierung der Ribonucleotide wird das kohäsive Ende am 5'- oder 3'-Ende der Fremd-DNA erzeugt; weiterhin bestimmt die Positionierung der Ribonucleotide die Kettenlänge (1-6) des übertragenen kohäsiven Endes.
    [0036] Das kohäsive Ende kann ausschließlich aus den Nucleotiden der Gruppen R1 und R2 stammen; es können jedoch zusätzlich noch Nucleotide aus der Spacerregion übertragen werden.
    [0037] Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann man das ein kohäsives Ende aufweisende, erste DNA-Fragment vor der Verknüpfung mit dem zweiten DNA-Fragment mit einer an sich bekannten, kohäsive Enden unterschiedlicher Restriktionsspezifizität aufweisenden Adapter-DNA umsetzen. Auch für diese Variante wird später noch ein Beispiel gegeben.
    [0038] Das Verfahren der Erfindung wird im folgenden anhand von bevorzugten Beispielen näher erläutert.
    [0039] Wenn in den Oligonucleotiden der allgemeinen Formel I R1 und R2 Sequenzen der allgemeinen Formel II bedeuten, d.h. z.B. die zentrale Erkennungsregion von Restriktionsendonucleasen der Klassen II und III, und (X)n eine kurze Spacerregion darstellt, lassen sich mit diesen Oligonucleotiden mit Hilfe von Ligasen, insbesondere T4-Polynucleotidligase Erkennungsregionen für Restriktionsendonucleasen in genetisches Material (DNA) einbauen. Dabei gestatten es die Oligonucleotide der Formel I, daβ nach erfolgter Kopplung und Klonierung die ursprüngliche Erbinformation in unveränderter Form zurückgewonnen wird. Dies wird dadurch erreicht, daß sich die den kohäsiven Teil beinhaltende Signalsequenz der Restriktionsendonuclease an den beiden Enden des Oligonucleotids befindet. Das folgende Beispiel 1 verdeutlicht die Vorteile, die mit einem Oligonucleotid der Erfindung der Formel d- (AATTCGAATT) erreichbar sind.
    [0040]
    Es wird deutlich, daß mit dem Verfahren bzw. dem Oligonucleotid der Erfindung die Erbinformation (1. DNA) nach Kopplung derselben mit dem Oligonucleotid der Erfindung bzw. der Linker-DNA, Spaltung unter Erzeugung eines kohäsiven Endes, Kopplung an eine zweite DNA (Vektor-DNA) mit einem komplementären kohäsiven Ende, Klonieren, erneute Spaltung und Abspaltung des kohäsiven Endes in unveränderter Form zurückerhalten wird.
    [0041] Die Einführung Endonuclease-spezifischer kohäsiver Enden gemäß der Erfindung hängt vom endständigen Basenpaar der ersten DNA ab. Einige Beispiele für die vier möglichen Basenkonstellationen sollen das Verfahren der Erfindung weiterhin erläutern:
    [0042] Beispiel 2
    [0043]
    [0044] Oligonucleotide I; AATTCGAATT (Signalsequenz für Eco Rl)
    [0045] GATCCGGATC (Signalsequenz für Barn HI)
    [0046] GTACCGGTAC (Signalsequenz für Kpn I )
    [0047] TCGACGTCGA (Signalsequenz für Sal I )
    [0048] AGCTCGAGCT (Signalsequenz für Sac I/Sst I )
    [0049] Beispiel 3
    [0050] '
    [0051] Oligonucleotide I: GATCTAGATC (Signalsequenz für Bgl II)
    [0052] TCGATATCGA (Signalsequenz für Cla I) AGCTTAAGCT (Signalsequenz für Hind III) AATTTAAATT (Signalsequenz für Aha III)
    [0053] Beispiel 4
    [0054]
    [0055] Oligonucleotide I: TGCAGCTGCA (Signalsequenz für Pst I)
    [0056] GATCGCGATC (Signalsequenz für Pvn I) TCGAGCTCGA (Signalsequenz für Xho I)
    [0057] Beispiel 5
    [0058]
    [0059] Oligonucleotide I: GATCATGATC (Signalsequenz für Bel I)
    [0060] GTAGATCTAG (Signalsequenz für Xba I)
    [0061] Für die Beispiele 1 - 5 ist die Kenntnis des endständigen Basenpaares der ersten DNA (Fremd-DNA) erforderlich. Demgegenüber genügt für einige Restriktionsendonucleasen das Vorhandensein der selbst komplementären Tetranucleotidsequenz, so daß diese Linker gemäß dem Verfahren der Er findung für jede Fremd-DNA verwendet werden können, gleichgültig, welches endständige Basenpaar dort vorliegt, d.h. nach Ankopplung einiger der Oligonucleotide der Erfindung wird immer das kohäsive Ende der entsprechenden Restriktionsendonuclease erzeugt. Im folgenden werden hierfür einige Beispiele gegeben.
    [0062] Beispiel 6
    [0063]
    [0064] Oligonucleotide I: GATCCGGATC (Signalsequenz für Mbol /Sau 3 A)
    [0065] TCGAGCTCGA (Signalsequenz für Taq I)
    [0066] AATTCGAATT (Signalsequenz für Eco Rl*)
    [0067] AGCTCGAGCT (Signalsequenz für Alu I)
    [0068] N ist eines der Nucleotide A, C, G und T; N' bedeutet das jeweils dazu komplementäre Nucleotid A, C, G und T.
    [0069] Im folgenden wird ein Beispiel für den Einsatz eines Oligonucleotids gegeben, in dem R1 eine Sequenz der Formel III und R2 eine Sequenz der Formel IV mit den dort angegebenen Definitionen für A, C, G und T bzw. A*, C*, G* und T* sowie N und N' bedeuten, wobei die Sequenzen von R1 und R2, von links nach rechts gelesen, bis auf die zueinander komplementären
    [0070] Nucleotide N und N' identisch sind.
    [0071] Beispiel 7
    [0072]
    [0073] Oligonucleotide I: GTCACCGGTGAC (Signalsequenz für Bst EII) Falls aufgrund des gegebenen endständigen Basenpaares der FremdDNA nicht direkt die gewünschten kohäsiven Enden erzeugt werden können, gelingt dies in einem zwischen den Spaltungs- und Verknüpfungsschritt eingeschalteten zusätzlichen Verfahrensschritt. Im nachfolgenden Beispiel 8 besitzt die erste DNA (Fremd-DNA) ein endständiges GC-Basenpaar, so daß die für Hind III spezifischen kohäsiven Enden nicht direkt eingeführt werden können. Es wird daher zunächst der Barn HI-Linker und danach eine Barn HI-/ Hind III-Adapter-DNA verwendet, um das gewünschte Ziel zu erreichen (Adapter-DNA kann als kurze DNA mit kohäsiven Enden unterschiedlicher Restriktionsspezifität definiert werden):
    [0074] Beispiel 8
    [0075]
    [0076] Eine Verfahrensführung gemäß Beispiel 8 ermöglicht letztlich die Einführung jedes kohäsiven Endes unabhängig davon, welches endständige Basenpaar die erste DNA trägt, wobei entsprechend dem erfindungsgemäßen Konzept die erste DNA unverändert zurückerhalten werden kann. Gemäß einer weiteren Variante des Verfahrens bzw. der Oligonucleotide der Erfindung können an definierten Positionen des Oligonucleotids Ribonucleotide eingebaut werden. Erfindungsgemäß können die Restriktionsendonuclease-spezifischen kohäsiven Enden auch ohne Verwendung der Restriktionsendonuclease eingeführt werden. Dies wird an den folgenden Beispielen 9 und 10 erläutert.
    [0077] Beispiel 9
    [0078] Kohäsives Ende für Eco Rl:
    [0079]
    [0080] Beispiel 1 0
    [0081] Kohäsives Ende für Pst I :
    [0082]
    [0083] In den Beispielen 9 und 10 werden, ebenso wie in der folgenden Beschreibung, Ribonucleotide durch * gekennzeichnet.
    [0084] Durch den Einbau eines Ribonucleotids wird innerhalb der DNA eine definierte alkalilabile Position geschaffen, wie sich aus dem folgenden Reaktionsschema ergibt:
    [0085]
    [0086] Dabei verbleibt der Phosphatrest der Internucleotidbindung am Ribonucleotid. Nach Behandlung mit Phosphatase wird eine 2', 3'-cis-Diolgruppierung geschaffen, die durch Perjodatbehandlung in bekannter Weise gespalten und ebenfalls in bekannter Weise unter milden alkalischen Bedingungen zur Eliminierung des Ribonucleotids führt. Zum Schluß wird durch erneute Phosphatasebehandlung das 3'-terminale Desoxyribonucleotid freigesetzt. Es kann vorteilhaft sein, diesen Schritt erst später in einer Reaktionssequenz durchzuführen, um dieses kohäsive Ende durch den 3'-Phosphatrest "geschützt" zu behalten.
    [0087] Ein weiterer Vorteil dieser Verfahrensvariante liegt darin, daß die Ribonucleotidpositionen so gewählt werden können, daß jeweils nur einer der beiden DNA-Stränge eine definierte alkalilabile Bruchstelle erhalten, bzw. der jeweils andere Strang durch die entsprechende Restriktionsendonuclease geschnitten werden kann. Dies wird im folgenden an zwei Beispielen erläutert: Beispiel 11
    [0088]
    [0089] Das Verfahren der Erfindung ermöglicht auch die Einführung von kohäsiven Enden, die nicht selbst komplementär sind. In diesem Falle ist R1 eine nicht in sich selbst komplementäre Tetra- oder Pentanücleotidsequenz oder eine in sich selbst oder nicht in sich selbst komplementäre Hexanucleotidsequenz der Formel V, VI bzw. VII gemäß dem Hauptanspruch (mit den dort angegebenen weiteren Definitionen); R2 ist stets eine zu R1 spiegelbildlich komplementäre Sequenz gleicher Länge mit 4, 5 oder 6 Nucleotiden. Wie weiter oben ausgeführt wurde, weist R1 und/order R2 ein 5'-oder 3'-endständiges Ribonucleotid auf, wobei gegebenenfalls in dem Spacer (X)n ein weiteres Ribonucleotid vorzusehen ist.
    [0090] In Abhängigkeit davon, wo die Ribonucleotide positioniert sind, kann - bei gleicher Nucleotidsequenz - die Länge des kohäsiven Endes beeinflußt werden und das kohäsive Ende entweder an das 3 ' - oder 5 ' -Ende der ersten DNA (Fremd-DNA) dirigiert werden. Die folgenden Beispiele erläutern diese Verfahrensvariante:
    [0091] Beispiel 13

    [0092] Beispiel 1 5
    [0093]
    [0094] Durch geeignete Positionierung der Ribonucleotide ist auch bei dieser Verfahrensvariante möglich, die alkalilabile Bruchstelle in jeweils nur einem der beiden DNA-Stänge einzuführen. Dies ermöglicht z.B. bei ringförmiger, doppelsträngiger, entweder die Isolierung des Minus-oder des Plus-Stranges.
    [0095] Das folgende Beispiel verdeutlicht, daß mit Oligonucleotiden I, in denen R1 und R2 in sich selbst oder nicht in sich selbst komplementäre Hexanucleotidsequenzen sind, kohäsive Enden erzeugt werden können, die, in Abhängigkeit von der Positionierung von Ribonucleotiden in den Resten R1, R2 bzw. X, Kettenlängen von 1 - 6 Nucleotiden aufweisen. Beispiel 1 7 :
    [0096]
    [0097] Die vorstehenden Beispiele offenbaren die große Flexibilität des Verfahrens der Erfindung, das immer dann von Vorteil ist, wenn DNA-Fragmente irreversibel miteinander verkoppelt werden
    [0098] sollen oder wenn sich die Anwendung von Restriktionsendonucleasen verbietet, weil das Vorhandensein interner Signalsequenzen sehr wahrscheinlich ist. Dies ist bei hochmolekularen DNA-Fragmenten, z.B. zur Etablierung einer Genbank, fast immer der Fall.
    [0099] Der in dem Oligonucleotid der Formel I enthaltene Spacer (X)n stellt kurze Oligonucleotidsequenzen dar, die als notwendiger Spacer unter Berücksichtigung der für die Restriktionsendonuclease-Erkennungsregion notwendigen Nucleotide und der erforderlichen Stabilität der durch Selbstkomplementarität sich bildenden doppeisträngigen DNA ausgewählt wird. Wird die zentrale Tetranucleotidsequenz nur durch die wenig Stabilität vermittelnden AT-Basenpaare gebildet, wie z.B. beim Eco RI- Linker
    [0100] d (AATTCGAATT)
    [0101] so kann die Stabilität z.B. durch Verlängerung des Spacers erhöht werden, z.B.
    [0102] d(AATTCGCGAATT).
    [0103] Dadurch kann eine weitere Erkennungsregion für eine Restriktionsendonuclease eingeführt werden, z.B. für X = CCCGGG hat der Eco RI-Linker die Formel
    [0104] Xmal Smal d(AATTCCCGGGAATT)
    [0105] Hier wird nicht nur mit dem Linker die Eco Rl-Signalsequenz in eine Fremd-DNA eingeführt, die GC als endständiges Basenpaar besitzt, sondern auch noch die recht seltene Erkennungssequenz für Smal/Xmal.
    [0106] Das folgende Ausführungsbeispiel betrifft die Herstellung und erfindungsgemäße Anwendung eines Oligonucleotids der Erfindung der Formel d (GATCCGGATC) .
    [0107] Beispiel 18
    [0108] Herstellung von d (GATCCGGATC) (vgl. Tetrahedron Let. 1983, 747)
    [0109] 100 mg C-Träger (10 μMol N-benzoyliertes C, kovalent gebunden an "Controlled Pore Glass" (CPG)y werden nacheinander mit je 100 μMol der durch MSNT (1,5 Äquivalente/PO~) aktivierten N-geschützten, 5 ' -dimethoxytritylierten Desoxynucleosid-3'- (2-chlorphenyl) -phosphodiester T, A, G, G, C, C, T, A und G umgesetzt. Ein Reaktionszyklus umfaßt Kondensation (45') in Pyridin, Waschen mit Pyridin, Capping mit Essigsäureanhydrid/ Pyridin (10'), Waschen mit Pyridin, CH2Cl2/MeOH (7 : 3) und Abspalten der Dimethoxytritylgruppe mit gesättigtem ZnBr2 in CH2Cl2/Methanol (7:3) für 10' und Waschen mit CH2Cl2/MeOH (7:3) sowie Pyridin.
    [0110] Die durchschnittlichen Kondensationsausbeuten liegen bei 90 - 95 %.
    [0111] Nach der letzten Kondensation erfolgt Abspaltung der 2-ChlorPhenylgruppe durch Behandeln mit Oximatreagenz (vgl. Tetrahedron Let. 1978, 2727),
    [0112] 3 ml, für 24 h, Abspaltung vom Träger und Entfernung der N-Arylgruppen durch Behandlung mit konzentriertem wässrigem Ammoniak, 12 h bei 50° C. Nach dem Einengen und 5-facher Extraktion mit je 5 ml CHCl3 wird die wässrige Lösung durch Anionaustauschchromatographie an DEAE-Cellulose in der üblichen Weise gereinigt (vgl. Liebigs Ann. 1978, 839 und Tetrahedron Let. 1983, 747).
    [0113] Das gereinigte Material wird in üblicher Weise durch Polyacrylamidgelelektrophorese (20 %, 7M Harnstoff) und Vergleich mit einem Homo-oligo-dT-Kettenlängenstandard und durch Sequenzierung entweder nach Maxam-Gilbert oder nach der "mobility shift"-Methode charakterisiert.
    [0114] Ligation:
    [0115] Um das Ligationssubstrat zu erhalten, wird pBR 322 mit Bai I (TGG^CCA) in üblicher Weise linearisiert und auf diese Weise die DNS mit dem stumpfen ^-Ende versehen. Die Ligation erfolgt in 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 0 , 4 itiM ATP und 4 Einheiten T4-Ligase pro 20 μl Reaktionsvolumen. Der Linker wird im 50-fachen Überschuß über die Termini verwendet. Die Ligationsdauer beträgt 24 h bei 10° C.
    [0116] Anschließend wird mit Barn HI in der üblichen Weise inkubiert; die entstandenen Barn Hl-kohäsiven Enden werden in gleicher Weise wie oben angegeben, jedoch mit lediglich 0,02 Einheiten T4- Ligase, pro 20 μl ligiert. Die Reaktionsdauer beträgt 1 h bei 22c C.
    [0117] Die Agarosegelelektrophorese zeigt Umwandlung der linearen pB R 322-DNS in circuläre DNS unter Ligationsbedingungen, unter denen nur kohäsive, nicht jedoch stumpfe Enden ligiert werden.

    权利要求:
    Claims Patentansprüche
    1. Verfahren zur definierten Verknüpfung doppelhelikaler DNA-Fragmente über kohäsive Enden mit den Schritten:
    1. Umsetzung eines ersten DNA-Fragmentes an dessen stumpfen Ende mit einer kurzen, beidseitig stumpfen doppelhelikalen Linker-DNA in Gegenwart von Ligasen,
    2. Spaltung der so erhaltenen DNA im Bereich der Linkersequenz unter Ausbildung des eine Sequenz von 1 - 6 Nucleotide aufweisenden kohäsiven Endes und
    3. Verknüpfung der so erhaltenen, das kohäsive Ende aufweisenden DNA mit einem ein kohäsives Ende aufweisenden zweiten DNA-Fragment in Gegenwart von Ligasen,
    wobei die kohäsiven Enden der ersten und zweiten DNA- Fragmente zueinander komplementär sind, dadurch gekennzeichnet, daß man als Linker-DNA ein in sich selbst komplementäres, unter Ligationsbedinqunqen als Doppelhelix vorliegendes oligonucleotid der allgemeinen Formel I
    (5') R1 - (X)n - R2 (3') (I)
    in der R1 und R2 von links nach rechts gelesen identische, in sich selbst komplementäre Tetradesoxy- oder Monoribotridesoxy- nucleotidsequenzen aus der Gruppe der Sequenzen der Formel II
    (5')A*ATT* (3') T*TAA* A*TAT* T*ATA* G*GCC* C*CGG*
    G*CGC* (II)
    C*GCG* G*ATC* G*TAC* C*ATG* C*TAG* A*CGT* A*GCT*
    T*CGA* T*GCA* in denen A, C, G und T bzw. A* , C* , G* und T* Adenin-, Cytosin-, Guanin- bzw. Thymidinnucleotide sind, wobei A*, C*, G* und T* entweder das 5'- bzw. 3'-endständige Desoxy- oder das 5'- bzw. 3' -endständige Ribonucleotid bedeuten und das Ribothymidinnucleotid T* durch das Ribouridinnucleotid ersetzt sein kann, oder
    R1 eine Pentadesoxy- oder Monoribotetradesoxynucleotid- sequenz aus der Gruppe der Sequenzen der Formel III
    (5*)A*ANTT* (3') T*TNAA* A*TNAT* T*ANTA* G*GNCC* C*CNGG* G*CNGC* C*GNCG*
    G*ANTC* (III)
    G*TNAC* C*ANTG* C*TNAG* A*CNGT* A*GNCT* T*CNGA* T*GNCA*
    bedeutet, wobei A, C, G und T bzw. A*, C* , G* und T* wie oben definiert sind und N eines der Nucleotide A, T, C oder
    G bedeutet, und R2 eine Pentadesoxy-oder Monoribotetradesoxynucleotid- sequenz aus der Gruppe der Sequenzen der Formel IV (5' )A*AN'TT* (3* ) T*TN'AA* A*TN'AT* T*AN*TA* G*GN*CC* C*CN'GG*
    G*CN*GC* (IV)
    C*GN'CG* G*AN'TC* G*TN'AC* C*AN'TG* C*TN'AG* A*CN'GT* A*GN'CT* T*CN'GA* T*GN'CA*
    bedeuten, wobei A, C, G und T bzw. A*, C* , G* und T* wie oben definiert sind, N' das zu N komplementäre Nucleotid A, T, C oder G ist und die Sequenzen der Gruppen R1 und R2 bis auf die zueinander komplementären Nucleotide N und N', von links nach rechts gelesen, identisch sind,
    oder R1 eine der durch Kombination der vier Nucleotide A, C, G und T möglichen, nicht in sich selbst komplementären Tetraoder Pentanucleotidsequenzen der Formeln V oder VI oder eine in sich selbst komplementäre oder nicht in sich selbst komplementäre Hexanucleotidsequenz der Formel VII (5')N1 -N2 -N3 -N4 (3') (V) (5')N1 -N2 -N3 -N4 -N5 (3') (VI)
    (5' )N1-N2-N3-N4-N5-N6(3') (VII)
    bedeuten,
    wobei N1, N2, N3, N4, N5 und N6 eines der Nucleotide A, T, C oder G ist, und R2 eine zu R1 spiegelbildlich komplementäre
    Tetra-, Penta- bzw. Hexanucleotidsequenz der Formeln V, VI bzw. VII mit den oben angegebenen Bedeutungen für N1, N2,N3, N4, N5 und N6 ist und entweder R1 eine Monoribotridesoxy-,
    Monoribotetradesoxy- oder Monoribopentadesoxynucleotid- sequenz und R2 eine Tetradesoxy-, Pentadesoxy- oder Hexadesoxy- nucleotidsequenz oder R1 eine Tetradesoxy-, Pentadesoxy- oder
    Hexadesoxynucleotidsequenz und R2 eine Monoribotridesoxy-
    Monoribotetradesoxy- oder Monoribopentadesoxynucleotid- sequenz ist, oder R1 eine zu R2 spiegelbildlich komplementäre Monoribotridesoxy-, Monoribotetradesoxy- oder Monoribopentadesoxysequenz ist, wobei sich das Ribonucleotid am 5'- oder 3'-Ende von R1 oder am 5' oder 3' -Ende
    2 von R2 befindet, und wobei 5'- bzw. 3'- ständiges Ribothymidin durch Ribouridin ersetzt sein kann.
    X ein Oligonucleotid aus der Gruppe der Sequenzen der Formel VIII
    (5') C*G* (3') G*C* T*A* A*T* G*CGG*
    G*GCC* (VIII)
    A*ATT* T*TAA* C*CCGGG* G*GGCCC* A*AATTT* T*TTAAA*
    in denen A, C, G und T bzw. A*, C* , G* und T* wie oben definiert sind, und
    n eine ganze Zahl von 1 - 5 bedeutet,
    verwendet,
    und die Spaltung der so erhaltenen doppelhelikalen DNA im Linkerbereich bei Nucleotidsequenzen, die keine Ribonucleotide enthalten, in an sich bekannter Weise mit einer für das zu erzeugende kohäsive Ende spezifischen Restriktionsendonuclease der Klassen II oder III und bei Ribonucleotide enthaltenden Nucleotidsequenzen mit Basen oder Ribonucleasen vornimmt.
    2. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das ein kohäsives Ende aufweisende erste DNA-Fragment vor der Verknüpfung mit dem zweiten DNA-Fragment mit einer an sich bekannten, kohäsive Enden unterschiedlicher Restriktionsspezifität aufweisenden Adapter-DNA umsetzt.
    3. Unter Ligationsbedingungen doppelhelikale Linker-DNA der Formel I
    (5')R1 - (X)n - R2(3') (I) in der R1, R2, X und n wie oben definiert sind.
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    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1985-02-14| AK| Designated states|Designated state(s): AU DK JP US |
    1985-02-14| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): AT BE CH DE FR GB LU NL SE |
    1985-03-04| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1984902585 Country of ref document: EP |
    1985-07-31| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1984902585 Country of ref document: EP |
    1988-10-12| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1984902585 Country of ref document: EP |
    优先权:
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